살아 있는 - 하이커우 HECS 그룹 유한회사

Nature Communications 13권, 기사 번호: 4337(2022) 이 기사 인용

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우리는 (i) 재설계된 바이러스 전사 조절 서열과 (ii) 삭제된 오픈 리딩 프레임(ORF) 3, 6, 7, 8(Δ3678)을 갖춘 생약독화 SARS-CoV-2 백신 후보를 보고합니다. Δ3678 바이러스는 일차 인간 기도 배양에서 야생형 SARS-CoV-2보다 약 7,500배 더 낮게 복제하지만, 백신 생산이 승인된 인터페론 결핍 Vero-E6 세포에서는 복제를 복원합니다. Δ3678 바이러스는 햄스터와 K18-hACE2 마우스 모델 모두에서 매우 약독화되었습니다. Δ3678 바이러스의 단일 용량 면역화는 야생형 바이러스 공격 및 전파로부터 햄스터를 보호합니다. Δ3678 바이러스에서 삭제된 ORF 중에서 ORF3a는 I형 인터페론 신호 전달 중 STAT1 인산화를 길항함으로써 가장 큰 약화를 설명합니다. 우리는 또한 높은 처리량 중화 및 항바이러스 테스트를 위해 mNeonGreen 리포터 Δ3678 바이러스를 개발했습니다. 종합적으로, 결과는 Δ3678 SARS-CoV-2가 생약독화 백신 후보이자 잠재적인 생물안전성 레벨 2 사용을 위한 연구 도구 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

SARS-CoV-2로 인한 COVID-19의 대유행으로 인해 확인된 감염자는 5억 1,300만 명이 넘고 사망자는 620만 명 이상으로 늘어났습니다(2022년 5월 1일 기준, https://coronavirus.jhu.edu/). mRNA, 바이러스 벡터, 서브유닛 단백질, 불활성화 바이러스 등 코로나19에 대한 다양한 백신 플랫폼이 성공적으로 개발되었습니다. SARS-CoV-2 생백신은 저렴한 비용, 강력한 면역원성, 잠재적으로 긴 면역 내구성이라는 장점이 있음에도 불구하고 적극적으로 연구되지 않았습니다1. SARS-CoV-2 비리온은 뉴클레오캡시드(N) 단백질로 코팅된 게놈 RNA로 형성된 내부 뉴클레오캡시드와 스파이크(S), 막(M)이 내장된 세포 유래 빌리피드 막으로 형성된 외부 외피로 구성됩니다. 및 외피(E) 단백질2. 플러스 센스 단일 가닥 바이러스 RNA 게놈은 복제 기계를 형성하는 16개의 비구조 단백질(ORF1a/ORF1b), 4개의 구조 단백질(S, E, M 및 N)에 대한 ORF(오픈 리딩 프레임)를 암호화합니다. 7가지 보조 단백질3. SARS-CoV-2 보조 단백질의 정확한 기능은 아직 밝혀지지 않았지만, 다른 코로나바이러스에 대한 이전 연구에서는 이러한 단백질이 바이러스 복제에 필수적이지는 않지만 숙주 경로와의 상호작용을 통해 복제 및 발병을 조절할 수 있음을 시사합니다4,5,6,7, 8. 따라서 보조 단백질의 결실은 SARS-CoV-2를 약화시키는 데 사용될 수 있습니다.

코로나바이러스는 전사 조절 서열(TRS)에 의해 매개되는 불연속 전사 메커니즘을 통해 하위 게놈 RNA(sgRNA)를 복제하고 전사합니다. TRS는 게놈의 5'말단 근처와 하류 ORF의 5'말단에 위치한 보존된 뉴클레오티드 서열입니다(그림 1a). 이러한 TRS는 리더 TRS와 본체 TRS 사이의 염기쌍을 통해 전사를 조절하여 하류 ORF를 번역하는 sgRNA의 생성을 유도합니다9,10,11. TRS 내에서 6~8개의 뉴클레오티드로 구성된 핵심 서열은 초기 RNA와 리더 TRS 사이의 염기쌍 형성을 안내합니다. SARS-CoV TRS 네트워크의 가이드 서열을 재배선하면 약독화된 바이러스가 생성될 수 있다는 것이 이전에 밝혀졌습니다. 이러한 TRS 돌연변이 SARS-CoV는 복귀 위험을 최소화하기 위한 생약독화 백신 접근법의 역할을 할 수 있습니다12,13.

Δ678 및 Δ3678 SARS-CoV-2 구성을 위한 계획 다이어그램. 삭제는 USA-WA1/2020 균주의 백본에 도입되었습니다. 녹색과 빨간색 상자는 각각 원래 TRS 시퀀스와 돌연변이된 TRS 시퀀스를 나타냅니다. T7 T7 프로모터, L 리더 서열, TRS 전사 조절 서열; ORF 개방형 판독 프레임, E 외피 당단백질 유전자, M 막 당단백질 유전자, N 뉴클레오캡시드 유전자, UTR 비번역 영역, pA 폴리 A 꼬리. b 재조합 WT, Δ678 및 Δ3678 바이러스의 플라크 형태. Vero-E6 세포에서 플라크 분석을 수행하고 감염 후 2.5일에 염색했습니다. c –e Vero-E6(c), Calu-3(d) 및 HAE(e) 세포에서 WT, Δ678 및 Δ3678 SARS-CoV-2의 복제 동역학. WT, Δ678 및 Δ3678 바이러스를 각각 MOI 0.01, 0.1 및 2로 Vero-E6, Calu-3 및 HAE 세포에 접종했습니다. 2시간 배양 후, 세포를 DPBS로 3회 세척하고 새로운 2% FBS DMEM 하에서 계속 배양하였다. Vero-E6 세포에 대한 플라크 분석을 사용하여 감염성 바이러스 역가에 대해 배양 상청액을 측정했습니다. f 감염 후 7일째 HAE 세포에서 WT, Δ678 및 Δ3678 RNA의 세포내 수준. HAE 세포를 PDBS로 3회 세척하고, RNA 분리를 위해 Trizol로 용해하고, RT-qPCR을 사용하여 바이러스 RNA에 대해 정량화했습니다. c – f 점은 개별 생물학적 복제물을 나타냅니다 (Vero-E6 및 Calu-3의 경우 n = 3, HAE의 경우 n = 5). 그래프의 값은 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. WT와 Δ678/Δ3678 그룹 간의 유의미한 차이를 확인하기 위해 짝을 이루지 않은 양측 t 테스트를 사용했습니다. 다중 비교를 설명하기 위해 Bonferroni 보정을 사용하여 P 값을 조정했습니다. p < 0.025이면 차이가 유의미한 것으로 간주됩니다. g MOI 0.5에서 mNG WT 또는 mNG Δ3678 바이러스로 감염된 후 mNG 양성 HAE 세포. 세 가지 독립적인 실험에서 얻은 mNG 양성 세포의 대표 이미지가 표시됩니다. mNG 양성 이미지의 낮은 해상도는 HAE 배양이 6웰 플레이트에 배치된 플라스틱 삽입물에 있는 다층 라이브 세포로 구성되었기 때문입니다. 스케일 바, 100μm. c – f 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.

660 (day 2) and >80 folds (day 2), respectively; no infectious viruses were detected in trachea (Fig. 3e) and lungs (Fig. 3f) from the immunized groups. The challenge significantly increased the neutralization titers (on day 21 post-challenge) in both the ∆3678- and WT virus-immunized groups (Fig. 3g), suggesting that a single infection with the ∆3678 or WT virus did not elicit sterilizing immunity. Histopathology analysis showed that immunization with attenuated ∆3678 virus reduced lung pathology score, inflammation, alveolar septa change, and airway damage (Supplementary Fig. 2). In contrast, previous infection with WT virus did not exhibit improved lung histopathology after the challenge, possibly because the observed pathologic changes were caused by the initial WT viral infection (Supplementary Fig. 2). Collectively, the results demonstrate that immunization with attenuated ∆3678 virus can protect against WT SARS-CoV-2 challenge in hamsters./p>5.6 × 106 PFU/ml on interferon-incompetent Vero-E6 cells (Fig. 1c), making large-scale production feasible in this vaccine manufacture-approved cell line or its derivative Vero-E6-TMPRSS2 cells. In contrast, the ∆3678 virus was highly attenuated when infecting immune-competent cells, as evidenced by the 7500-fold reduction in viral replication of WT virus on human primary HAE cells (Fig. 1e). In both hamster and K18-hACE2 mouse models, the ∆3678 infections did not cause significant weight loss or death at the highest tested infection dose [106 PFU for hamsters (Fig. 2b) and 4 × 104 PFU for K18-hACE2 mice (Fig. 4c, g)], whereas the WT virus caused weight loss and death at a much lower infection dose (>4 × 102 PFU for K18-hACE2 mice; Fig. 4b, f). Analysis of individual ORF deletion viruses identified ORF3a as a major accessory protein responsible for the attenuation of the ∆3678 virus (Fig. 5b); this conclusion was further supported by the observation that the addition of ∆3a to the ∆678 virus significantly increased the attenuation of ∆3678 replication (Fig. 1c–f). Our results are supported by a recent study reporting that ∆3a SARS-CoV-2 and, to a less extend, ∆6 SARS-CoV-2 were attenuated in the K18-hACE2 mice34. Mechanistically, we found that ORF3a protein antagonized the innate immune response by blocking STAT1 phosphorylation during type-I interferon signaling. Thus, the deletion of ORF3a conferred SARS-CoV-2 more susceptible to type-I interferon suppression. Our results are supported by previous reports that expression of SARS-CoV-2 ORF3a alone antagonized type-I interferon signaling19,35. The ORF3a protein was recently shown to form a dimer in the cell membrane with an ion channel activity36, which may account for its role in cell membrane rearrangement, inflammasome activation, and apoptosis37,38,39. Whether the ion channel activity of ORF3a is required for the inhibition of STAT1 phosphorylation remains to be determined./p>